Febbraio 2017

Effect of the Acidic Dental Resin Monomer
10-methacryloyloxydecyl Dihydrogen Phosphate on
Odontoblastic Differentiation of Human Dental Pulp Cells

Eun-Cheol Kim1, Haejin Park2, Sang-Im Lee3 and Sun-Young Kim2

1Department of Oral and Maxillofacial Pathology & Research Center for Tooth and Periodontal Tissue Regeneration (MRC), School of Dentistry, Kyung Hee University, Seoul, Korea, 2Department of Conservative Dentistry, School of Dentistry, Kyung Hee University, Seoul, Republic of Korea and 3Department of Dental Hygiene, School of Health Sciences, Dankook University, Cheonan, Republic of Korea

Introduzione

La ricostruzione degli elementi dentari utilizza comunemente compositi ed adesivi dentali i cui componenti principali sono monomeri resinosi come il Tetraetilene glicol dimetacrilato (TEGDMA), il 2 idrossietilmetacrilato (HEMA) ed il Bisfenol glicidil metacrilato (Bis-GMA).

Una certa quantità di questi monomeri rsinosi resta non polimerizzato anche dopo il processo di polimerizzazione. Il monomero non polimerizzato può penetrare all’interno del tessuto pulpare raggiungendo concentrazione elevate anche senza esposizione della pulpare e può alterare l’attività fisiologica delle cellule della polpa.

I monomeri resinosi come TEGDMA, HEMA e BIS_GMA hanno dimostrato di indurre citotossicità ed aptosi nelle cellule pulpari attraverso la formazione di sostanze reattive all’ossigeno (ROS) e riduzione del glutatione (GSH). Inoltre è stato dimostrato che concentrazioni minimamente tossiche di possono avere effetti negativi sulla differenziazione delle cellule pulpari in odontoblasti e ciò influenza il processo di mineralizzazione che è un importante meccanismo di protezione del tessuto pulpare in risposta agli stimoli nocivi esterni.

Tutti i monomeri acidi resinosi contengono un gruppo polimerizzabile che reagisce con gli altri monomeri resinosi ed un gruppo funzionale acido che può mordenzare i tessuti duri.

Questi monomeri sono oggi usati come componente principale di molti materiali dentali a base resinosa come adesivi e cementi compositi.

Il 10 methacryloyloyldecyl dihydrogen phosphate (10-MDP) è il più frequente monomero acido e contiene un gruppo diidrogeno fosfato per mordenzare i tessuti duri ed un gruppo metacrilato per i legami crociati con altri monomeri resinosi. Inoltre il 10-DMP è noto per interagire molto intensamente con l’idrossiapatite e forma un legame molto più stabile con il calcio a confronto degli altri monomeri resinosi.

Tuttavia, nonostante il suo frequente uso clinico l’effetto del 10-MDP sulle cellule pulpari non è stato ancora ben studiato.

In questo studio si sono voluti individuare gli effetti del 10-MDP sulla polpa ed il loro meccanismo d’azione. Inoltre si è cercato di stabilire la minima quantità tossica sufficiente in grado di influire sulla differenziazione odontoblastica, sulla risposta infiammatoria e di individuare il meccanismo che coinvolge l’HO-1.

Materiale e metodi

Dopo aver reperito i vari componenti e le sostanze necessarie per lo studio sono valutati i seguenti parametri:

  • Vitalità delle cellule pulpari
  • Esame della fosfatasi Alcalina
  • Colorazione al Red Alzarin
  • Reazione a catena della transcriptasi inversa
  • Esame delle citochine
  • Esame dell’attività dell’HO
  • Analisi statistica

Le cellule pulpari gentilmente procurate dal professor Takashi furono coltivate in alfa-MEM addizionata del 10% di FBS, di 100 U/Ml DI penicillina e 100 microgrammi/L di streptomicina in atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37° C. Quando le cellule furono cresciute dell’80% vennero trattate con 0,25% di tripsina/1 Mm/EDTA e mantenute come cellule pulpari (DPCs)

Il 10-DMP venne disciolto in DMSO (Sigma St. Louis) e diluito progressivamente in quattro differenti concentrazioni da 25 a 200 micromoli. La massima concentrazione di DMSO in tutti i trattamenti fu di 0,1%. La coltura di DPCs venne lavata con una soluzione salina tamponata, trattate con trypsin/EDTA e seminata in piastre con tre diverse concentrazioni cellulari: 96 well, 24 welle 6 well, rispettivamente 103, 3X 104, 105 o su piatti di coltura di 60 mm a concentrazione di 106 e fatte crescere all’80% in circa 16 ore.

Dopo aver rimosso il medium dalla coltura le cellule delle piastre 96 well furono trattate per la valutazione della vitalità, quelle delle piastre 24 well per l’esame delle citochine e quelle 6 well per l’esame dell’attività della fosfatasi alkalina e l’esame della colorazione red Alzarin. Inoltre i piatti da 60 mm furono utilizzati per l’esame della transcriptasi inversa.

Tutti i campioni furono trattati con 10-MDP con concentrazioni di 25,50,100 e 200 micromoli e con TEGDMA 0,3 Mm. Le cellule furono poi incubate per 14 giorni.

Risultati

Effetti sulla citotossicità e sulla differenziazione odontoblastica
Per questa valutazione è stato preso come riferimento il TEGDMA che alla concentrazione do 0,3 mM non riduce in modo significativo la vitalità pulpare, nello stesso modo il 10-MDP ad fino ad una concentrazione di 100mM non presenta effetti negativi mentre la sua citotossicità diventa significativa per concentrazioni superiori.

Effetti sulla risposta infiammatoria
Per tale valutazione è stata misurata la produzione dei mediatori pre-infiammatori e delle citokine.
La produzione di NO e di PGE2 sono concentrazione dipendenti ed alle concentrazioni testate per il 10-MDP risulta inferiore a quella relativa al TEGDMA.

Coinvolgimento dell’HO-1 sulla risposta infiammatoria e sulla differenziazione cellulare.
L’HO-1 è una proteina che risponde agli stress ed aumenta con l’utilizzo del 10-MDP in modo concentrazione-dipendente fino ai 200 micromoli e raggiunge la sua massima espressione dopo 24 ore.

Discussione

Sebbene molte resine adesive contengano monomeri acidi resinosi essi sono usati in odontoiatria poco si sa sugli effetti di basse concentrazioni sulla citotossicità e sull’alterazione delle funzioni fisiologiche delle cellule pulpari umane.

A questo riguardo è stata individuata la minima concentrazione tossica di 10-MDP che sortisce effetti simili al TEGDMA per ciò che riguarda la citotossicità, la differenziazione odontoblastica e la risposta infiammatoria.

Una concentrazione pari a 100 micromoli di 10-MDP è stata individuata come la concentrazione alla quale il 10-MDP presenta effetti analoghi a 0,3 micromoli di TEGDMA per quanto riguarda la citotossicità, mentre gli effetti sulla infiammazione e sui suoi mediatori risultano essere concentrazione dipendenti ma leggermente inferiori a quelli prodotti dal TEGDMA.

Il meccanismo d’azione resta però ancora non chiaro anche se sembra che il 10-MDP causi un danno alla membrana cellulare legato alla sua stretta interazione con lo strato fosfolipidico.

Nell’analisi degli effetti sulla differenziazione degli odontoblasti è stata evidenziata una notevole capacità di inibizione sui noduli di mineralizzazione e sui marker dell’mRNA preposti alla differenziazione stessa. Tali effetti sembrano superiori a quelli già individuati per il TEGDMA ed inoltre si ipotizza che vi sia una diretta interazione del 10-MDP con il calcio prodotto dagli odontoblasti e di conseguenza vi siano effetti negativi sulla produzione di dentina di terziaria.

Un altro aspetto interessante che risulta dal presente studio è l’azione degli antiossidanti sulla stimolazione dei mediatori dell’infiammazione quali HO-1, MAPK, NF-Kb e Nrf2.

L’HO-1 è il principale mediatore dell’infiammazione indotta dal 10-MDP sulle cellule pulpari e la sua produzione viene inibita in modo significativo dall’utilizzo di 10 micromoli di protoprphyrin IX (SnPP), il trattamento con SnPP per un ora riduce inoltre in modo significativo gli effetti negativi del 10-MDP sulla crescita cellulare.  Il trattamento con 10 mM di buthionine suphoximina (BSO) così come con 20nM di N-Acetilcisteina (NAC) oppure con 25 mM di Resveratol, tre antiossidanti, pur se non diminuisce la citotossicità inibisce la produzione di Reactive Oxigen Species (ROS), Glutatione GSH, ed altri mediatori dell’infiammazione.

A tal proposito gli autori propongono in caso di utilizzo di 10-MDP il pre-trattamento delle cavità soprattutto se profonde con antiossidanti al fine di ridurre la risposta infiammatoria a livello pulpare anche se sono necessari ulteriori studi in proposito.

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