Marzo 2011

Comparazione dei livelli di endotossine nelle infezione endodontiche primarie

Lo studio è stato strutturato per determinare quale dei metodi quantitativi tra il metodo cromo genico cinetico, il metodo turbidimetrico e il metodo cromogenico con end point, utilizzati per l’analisi delle infezioni endododontiche primarie fosse il più attendibile.
Materiali e Metodi:
Per questo studio sono stati selezionati 21 pazienti, che necessitavano di trattamento endodontico con un’età compresa tra 13 e 73 anni. I campioni sono stati raccolti da 21 canali radicolari con necrosi pulpare, determinata attraverso i test di sensibilità (dolore alla palpazione, presenza di essudato, alla percussione) e con segni radiografici evidenti di periodontite apicale. I denti selezionati presentavano tasche non più profonde di 4 mm. Tutti i materiali usati sono stati sterilizzati a caldo a 200°C per 4 ore, cosi da renderli apirogenici. Gli elementi dentari sono stati isolati con diga di gomma, le corone disinfettate nell’ordine con, acqua ossigenata al 30% per 30 secondi, NaOCl al 2,5% per altri 30 secondi. Successivamente è stato utilizzato sodio trisolfato per inattivare il disinfettante. La preparazione della cavità di accesso, è stata eseguita utilizzando fresa diamantata sterile, su manipolo ad alta velocità sotto irrigazione manuale con soluzione salina sterile. Il primo passaggio aveva lo scopo di asportare il maggior numero di contaminanti mentre, nel secondo passaggio, la cavità di accesso è stata disinfettata prima di accedere alla camera pulpare. L’accesso ai canali è stata effettuato con fresa sterile e apirogenica sotto irrigazione. Il campione di endotossine è stato prelevato con un cono di carta sterile e apirogenico, inserito all’interno del canale e tenuto in posizione per 60 secondi, quindi, immediatamente messo in provetta di vetro sterile e congelato a – 80°C. I lipopolisaccaridi (LPS, endotossine) sono componenti esterni delle membrane dei batteri gram negativi, coinvolti in modo predominante nelle infezioni dei canali radicolari, e sono importanti mediatori nella patogenesi della periodontite apicale. Nel corso degli anni, le ricerche non hanno solo tentato di studiare i livelli di LPS nei canali infetti, correlando l’alto livello di endotossine ai segni/sintomi clinici e radiografici riscontrati , ma hanno anche valutato l’effetto dei trattamenti canalari volti alla loro eliminazione , utilizzando il sistema di coagulazione Limulus Ambocytes Lysate (LAL), estratto acquoso di amebociti, uniche cellule del sangue del Lymulus Polyphemus, detto anche granchio a ferro di cavallo. Il LAL reagisce con le endotossine batteriche (pirogeni), componente principale della membrana dei batteri Gram Negativi, nello specifico utilizza una serina proteasi catalitica della cascata coagulativa, attivata dalla presenza di endotossine batteriche. Questa reazione è la base delle tre differenti metodiche LAL test: gel-clot, cromogenico e turbidimetrico che differiscono nel tipo di risultato finale e nel valore di endotossina rilevabile indicata con EU/ml (Unità di Endotossine per millilitro). A causa dell’estrema sensibilità delle endotossine, il metodo LAL è il più ampio sistema utilizzato per l’analisi del contenuto endodontico.
- Gel Clot: è un metodo qualitativo o semi-quantitativo in cui viene sfruttata la caratteristica del lisato delle cellule del sangue del Lymulus di formare un coagulo compatto sul fondo della provetta in presenza di endotossine attraverso un saggio con endpoint coagulogeno. La lettura dei risultati, possibile dopo 60 minuti d’incubazione in termostato a secco a 37°C, si esegue semplicemente capovolgendo la provetta di 180° ed osservando la presenza di un coagulo compatto che non si stacca dal fondo. Esistono 4 tipologie diverse di lisato che si differenziano per la massima sensibilità di determinazione endotossinica: 0.25 EU/ml., 0.125 EU/ml., 0.06 EU/ml. e 0.03 EU/ml..
- Metodo cromogenico: è un metodo d’analisi quantitativo cinetico (KQCL) o end-point (QCL) in cui il lisato sviluppa colore in presenza di endotossine. Maggiore è la concentrazione di endotossina nel campione, più velocemente viene emesso colore che viene misurato come valore di densità ottica (OD) o assorbanza per spettrometria: l’intensità del colore giallo viene determinata con una densità ottica pari a 405 nm.. Il test richiede un software dedicato, con possibilità d’incubazione a 37°C. I valori di endotossina nei campioni vengono calcolati sulla curva standard costruita con diverse concentrazioni note di endotossina di riferimento internazionale. Il metodo cromogenico usa il substrato sintetico del peptide pNA (peptide nucleic acid) che, scisso da un enzima di coagulazione, dà il colore giallo alla soluzione e permette un’analisi quantitativa. Con questo metodo è possibile rilevare fino a 0.005 EU/ml.
- Metodo turbidimetrico: è un metodo d’analisi cinetico quantitativo in cui il lisato sviluppa torbidità in presenza di endotossine. Maggiore è la concentrazione di endotossina nel campione, più velocemente si sviluppa torbidità che viene letta come valore di densità ottica (OD) pari circa a 340 nm.. Con il metodo cinetico-turbidimetrico si determina sia l’incremento quantitativo della torbidità, sia il tempo impiegato dalla reazione per raggiungere un particolare livello di torbidità ( tempo limite o valore soglia). Il test richiede l’impiego di una specifica apparecchiatura per incubare i campioni ad una temperatura controllata di 37°C e per leggere i valori di OD ad intervalli regolari. I valori di endotossina nei campioni vengono calcolati sulla curva standard costruita con diverse concentrazioni note di endotossina di riferimento internazionale (0.01 - 0.10 - 1.0 EU/mL). L’analisi turbimetrica è molto rapida, semplice e soprattutto molto sensibile: è possibile determinare fino a 0.001 EU/ml
- QCL: è limitato dalla mancanza di sensibilità (limiti di rilevamento è 0.1-1 EU/mL). La densità ottica viene registrata in un unico tempo di circa 16 minuti che ne compromette, appunto la sensibilit�
- KQCL e il test turbidimetrico : sono metodi più precisi e più sensibili (rispettivamente 0.005-50 EU/mL e 0.01-100 EU/mL), questo perché richiedono un tempo di 60 minuti che permette che la quantificazione delle endotossine sia più sensibile, ovvero abbia un range di sensibilità maggiore.
Conclusioni:
Tutti e tre i metodi LAL sono efficaci nell’individuazione di endotossine infatti queste sono state rilevate nel 100% dei canali radicolari campionati. I risultati ottenuti (valori medi) sono stati indicativi per la riproducibilità e la precisione dei test:
o QCL : 34.20 EU/mL
o KQCL: 7.49 EU/mL
o TURBIDIMETRICO: 9.19 EU/mL
Nei test cinetici si osservano dei valori poco distanti, il coefficiente di variazione è stato stimato essere sotto al 10% e per questo motivo sono considerati più precisi e più semplici da riprodurre. Questo può essere spiegato sia dal fatto che richiedono un tempo maggiore, potendo cosi sviluppare un range di sensibilità più ampio, sia dal loro metodo di esecuzione che prevede l’uso di un singolo reagente, il che rende il test sicuro, veloce e accurato. Il test cromo genico mediante endpoint, invece fornisce un valore molto diverso, circa cinque volte maggiore e questo, suggerisce un’interferenza con il substrato LAL da parte del campione. Inoltre, vale la pena ricordare che questo metodo utilizza due passaggi: il primo, per attivare il substrato, e il secondo, in cui si aggiunge il substrato cromo genico, entrambi dipendenti dal tempo e dalla temperatura. Il pH è un altro parametro che gioca un ruolo importante nella reazione di LAL: il pH ideale per l’enzima che attiva la reazione LAL si colloca tra 6.0 e 8.0, ma spesso può verificarsi una sua regolazione nel campione soprattutto dopo l’uso di sostanze chimiche quali sodio ipoclorito, clorexidina o EDTA. In conclusione si può affermare che il sistema LAL è molto affidabile nella quantificazione delle endotossine tuttavia, il valore fornito dal test cromo genico mediante endpoint non è riconciliabile con i valori ottenuti nei test cinetici cromo genico e turbidimetrico, che, dunque, si adattano meglio all’analisi delle tossine presenti nel canale fornendo un livello di precisione, riproducibilità e attendibilità decisamente più alto.


Comparison of Endotoxin Levels in Previous Studies on Primary Endodontic Infections
Frederico C. Martinho, DDS, MSc, Wanderson M.M. Chiesa, DDS, MSc, PhD, Alexandre A. Zaia, DDS, MSc, PhD, Caio C.R. Ferraz, DDS, MSc, PhD, Jose F.A. Almeida, DDS, MSc, PhD, Francisco J. Souza-Filho, DDS, MSc, PhD, and Brenda P.F.A. Gomes, DDS, MSc, PhD
From the Department of Restorative Dentistry, Endodontics Division, Piracicaba Dental School, State University of Campinas, Sao Paulo, SP, Brazil
(J Endod 2011;37:163–167)

Abstract:
This study was performed to determine which of the quantitative methods, namely, chromogenic endpoint, chromogenic kinetic, and turbidimetric kinetic ones, best fit for the analysis of primary endodontic infections. Methods: Twenty-one root canals with apical periodontitis were sampled with paper points. The same sample was analyzed by means of the endpoint chromogenic Limulus amebocyte lysate (LAL) assay (QCL), quantitative kinetic chromogenic LAL assay (KQCL), and kinetic turbidimetric LAL assay (Turbidimetric). Results: All three LAL methods were effective in the recovery of endotoxin from root canal infection. Regardless of the method tested, endotoxin was detected in 100% of the root canals (21/21). The KQCL assay yielded a median value of endotoxin of 7.49 EU/ mL, close to and not significantly different from those for the turbidimetric test (9.19 EU/mL) (both kinetic methods) (p > 0.05). In contrast, the endpoint QCL showed a median value of 34.20 EU/mL (p v 0.05). The comparison of the three methods revealed that both turbidimetric and KQCL methods were more precise, with best reproducibility (the coefficient variation between analysis of the root canal and its duplicate was lower than 10%). The inhibition/enhancement assay indicated a good interaction between the root canal samples with the turbidimetric method. Conclusion: This study has revealed that quantitative kineticturbidimetric and kinetic-chromogenic LAL methods are best fitted for the analysis of endotoxins in root canal infection, both being more precise and allowing better reproducibility compared with the endpoint-QCL assay.

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