Novembre 2014

L’espressione di CX3CL1 e del suo recettore, CX3CR1, nello sviluppo delle lesioni periapicali

L. Wang1, Z. Sun2, L. Liu2 & B. Peng2

1Department of Operative Dentistry and Endodontics, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, Wuhan; and

2State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory of Oral Biomedicine

Ministry of Education School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, Wuhan, China

Sommario

Obiettivo: studiare l'espressione di CX3CL1 e il suo recettore, CX3CR1, nello sviluppo delle lesioni periapicali indotte nei ratti e valutare il possibile ruolo di queste molecole nella patogenesi delle lesioni periapicali.

Metodologia: sono state indotte delle lesioni periapicali nei primi molari mandibolari di 30 ratti a seguito dell’esposizione della polpa all'ambiente orale. Gli animali sono stati sacrificati al giorno 0, 7, 14, 21, 28 e 42 dopo l'induzione della lesione.

Lo sviluppo di lesioni periapicali è stato studiato con valutazioni di carattere istologico ed enzimatico-istochimico. Le distribuzioni di CX3CL1 e CX3CR1 nel tessuto periapicale sono state esaminate con  colorazione immunoistochimica ed immunofluorescenza. Gli osteoclasti e le cellule CX3CL1-positive sono stati contati in ciascun campione. I dati sono stati poi analizzati da one-way ANOVA utilizzando il pacchetto statistico SPSS 13.0.

Risultati: Le lesioni si sono estese dal giorno 0 al 14 e successivamente si sono stabilizzate. Quando l’aumento della dimensione della lesione periapicale era più evidente, si sono osservate numerose cellule CX3CL1-positive in tutto il forame apicale e nelle aree periapicali adiacenti. Dai giorni 21-42, i tessuti connettivi soggiacenti presentavano un’intensa colorazione immunoistochimica positiva per CX3CL1 in cellule infiammatorie con diverse morfologie, tonda, ovale e fibroblastica. Il numero di cellule CX3CL1 positive aumentava dal giorno 7 al 28, ma diminuiva nel post-operatorio, il giorno 42. La doppia immunofluorescenza ha mostrato la presenza di cellule positive per CX3CL1 e CX3CR1 intorno alle lesioni periapicali che circondavano il forame apicale.

La maggior parte delle cellule CX3CL1-positive era mononucleata, evento che suggerisce la presenza di macrofagi, neutrofili e linfociti infiltranti sovrapposti con cellule che presentano CX3CR1.

Conclusioni: CX3CL1 e CX3CR1 sono legati allo sviluppo delle lesioni periapicali. La chemochina

e il suo recettore possono essere coinvolti nella progressione della distruzione tissutale e tra questi fenomeni ad esempio il riassorbimento osseo negli stati di infiammazione periapicale.

Parole chiave: CX3CL1, CX3CR1, infiammazione, osteoclasti, lesioni periapicali.

Introduzione

Le chemochine sono un gruppo di citochine strutturalmente simili che regolano la migrazione e l'attivazione di leucociti ed altri tipi di cellule che esprimono un gruppo di sette recettori transmembrana accoppiati a G-protein. Le chemochine possono essere classificate in quattro sottofamiglie in base alla disposizione dei residui aminoterminali di cisteina, chiamati CXC, CC, C e CX3C (Yoshie et al. 2001). CX3CL1 (anche chiamato fractalkine), l'unico membro noto della sottofamiglia CX3C, ha una duplice funzione nelle cellule che esprimono il suo recettore, CX3CR1. CX3CL1 è un potente fattore chemiotattico nella sua forma solubile e nella sua forma legata alla membrana agisce come una efficace molecola che media l’adesione cellulare

(Imai et al. 1997 Fong et al. 1998). L’asse CX3CL1-CX3CR1 può essere particolarmente utile in situazioni biologiche dove sia l’attrazione e sia le interazioni cellula-cellula successive sono necessarie (Koizumi et al. 2009).

Sulla base delle sue proprietà chemiotattiche ed adesive, è stato suggerito che CX3CL1 svolga un importante ruolo nel processo infiammatorio. Ad esempio, durante i processi di flogosi, i monociti nel sangue periferico e nel  liquido sinoviale esprimono CX3CL1. CX3CL1 viene espresso anche da macrofagi, fibroblasti, e cellule endoteliali e dendritiche del tessuto sinoviale nell’artrite reumatoide (Ruth et al. 2001). La presenza di CX3CL1 e CX3CR1 nei linfociti e la loro aumentata espressione cellulare è stata osservata durante i processi infiammatori (Jones et al. 2010). Le confutazioni accumulate indicano come CX3CL1 e CX3CR1 siano coinvolti nella patogenesi di varie patologie infiammatorie, come la glomerulonefrite, l’artrite reumatoide, il lupus eritematoso sistemico e l’aterosclerosi (Torabinejad et al. Del 1985, Chen et al. Del 1998,

Ruth et al. 2001 Damas et al. 2005 Yajima et al. 2005 Matsunawa et al. 2006 Fevang et al. 2009).

Koizumi et al. (2009) hanno dimostrato per la prima volta che CX3CL1, che viene espresso dagli osteoblasti, svolge un importante ruolo nei processi di osteoclastogenesi per mezzo del  CX3CR1, che è espresso dai precursori degli osteoclasti. L’asse CX3CL1-CX3CR1 può essere un nuovo bersaglio terapeutico per intervenire su malattie in cui si ha un alterato riassorbimento osseo, come l'artrite reumatoide, l'osteoporosi, e le metastasi ossee.

La parodontite apicale è una malattia comune causata da batteri del sistema dei canali radicolari dei denti. È una malattia con riassorbimento osseo infiammatorio in cui il  meccanismo patologico è caratterizzato dall'attivazione di cellule immunocompetenti che producono una vasta gamma di mediatori infiammatori (Marton & Kiss 2000). Diverse citochine e chemochine, che promuovono la migrazione selettiva delle cellule attraverso il legame con specifici recettori cellulari di superficie, sono state identificate nelle lesioni periapicali. Le chemochine CXC, come CXCL8 o CXCL1, sono stati repertate nelle lesioni periapicali (Marton et al. 2000). Anche se i macrofagi potrebbero essere stimolati dalle chemochine CXC (Rigamonti et al. 2008), vengono espressi prevalentemente recettori per le CC chemochine quali CCR1, CCR2 e CCR5. Questi

recettori rendono i macrofagi maggiormente sensibili alle CC chemochine, come CCL1, CCL2 e CCL5 (Conti & DiGioacchino 2001). Recentemente,alcuni studi in vitro hanno suggerito che CCR2 sia anche coinvolto nella biologia osteoclastica. CCL2 induce la differenziazione degli osteoclasti e

promuove la loro sopravvivenza (Scheven et al. del 1999, Kim et al. 2006a, b). E’ stato trovato anche che CCR2 fosse sovraregolata nelle lesioni periapicali umane, e che CCL2 fosse maggiormente prevalente nelle cisti rispetto ai granulomi, evento che suggerisce che l'attivazione di CCR2 potrebbe svolgere un ruolo diverso nella progressione di queste malattie (Silva et al.

2005). Nessuno studio ha esplorato l'espressione CX3CL1 nelle lesioni periapicali.

Data l’importanza dell'asse CX3CL1-CX3CR1 nelle malattie infiammatorie e nella distruzione ossea, era stato ipotizzato che questo fosse anche coinvolto nella patogenesi delle lesioni periapicali. Finora, i rapporti noti tra l’asse CX3CL1- CX3CR1 e la parodontite apicale sono limitati. Il presente studio si propone di investigare le espressioni di CX3CL1 e CX3CR1 nei tessuti periapicali del ratto durante lo sviluppo della parodontite apicale.

Materiali e metodi

Descrizione del protocollo animale e del gruppo sperimentale

Sono stati seguiti i protocolli animali approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale di Stomatologia e della Wuhan University School. Trenta ratti maschi Wistar, di peso di 230-270 g ciascuno, sono stati acquistati dal Experimental Animal Centre della Wuhan University. I ratti sono stati divisi casualmente in cinque gruppi e alimentati con acqua e cibo ad libitum per tutto il periodo sperimentale.

Induzione sperimentale delle lesioni periapicali

Il giorno 0, tutti gli animali sono stati anestetizzati con ketamina (90 mg / kg intraperitoneale), e i tessuti pulpari del primo molare destro e sinistro sono stati esposti utilizzando una fresa rotonda numero 1/4 fino a che la testa della fresa non affondava nella camera pulpare. I tessuti pulpari sono stati lasciati esposti all'ambiente orale senza alcuna protezione / copertura durante

tutto il periodo di sperimentazione per consentire la contaminazione del sistema canalare e conseguentemente indurre la formazione di lesioni periapicali (Stashenko et al. 1994).

Cinque ratti di ciascun gruppo sono stati sacrificati al giorno 0 (controllo negativo), 7, 14, 21, 28 e 42 successivamente all'esposizione della polpa, e i loro mascellari inferiori sono stati espiantati.

L'esame istologico

I mascellari di ratto di ciascun gruppo sono stati fissati con paraformaldeide al 4% in 0.1 mol / L di tampone fosfato (pH 7,4) a 4 ° C per 2 giorni. Sono stati poi trasferiti in una soluzione di EDTA al 10% a 4 ° C per 2 settimane perché si demineralizzassero. I campioni sono stati disidratati in etanolo ed inclusi in paraffina. Sono state ottenute sezioni seriali in senso mesio-distale con uno spessore di circa 6 µm. Sono state selezionate per la colorazione le sezioni che includevano la radice distale dei primi molari mandibolari e che mostravano una pervietà dell’apice del canale radicolare.

Esame istochimica enzimatica

La fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) è un marcatore biochimico considerato relativamente specifico per gli osteoclasti (Minkin 1982). Per identificare gli osteoclasti, l’attività TRAP  è stata rilevata con un kit TRAP (Sigma, St. Louis, MO, USA). Le sezioni che contengono la regione periapicale sono state selezionate e sottoposte ad esame dell'attività TRAP.

Le procedure sono state eseguite come precedentemente descritto (Zhang et al. 2010). In breve, le sezioni sono state reidratate, lavate e incubate in una soluzione di acido fosforico naftolo AS-BI e fast garnet GBCper 1 ora a 37 ° C. Dopo l'incubazione, le sezioni sono state colorate con l’ematossilina. Alcune sezioni sono state incubate in terreno privo di substrato così da servire  come controlli dell’attività TRAP. Le cellule multinucleate positive per il TRAP sono state considerate osteoclasti.

Esame immunoistochimico

Gli anticorpi policlonali di capra contro CX3CL1 di origine umana (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) in diluizione 1: 100 sono stati utilizzati come anticorpo primario. Le sezioni sono state lavate e colorate utilizzando un Kit contenente streptavidina-perossidasi (SP) (Zhongshan Biotecnologie Co., Pechino, Cina) secondo le indicazioni del produttore. In breve, dopo che le sezioni sono state reidratate, l'attività della perossidasi endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo un lavaggio con acqua distillata, le sezioni sono state incubate con un normale siero di capra per  20 min a temperatura ambiente e poi con l’anticorpo primario per 24 ore a 4 ° C. Dopo il lavaggio con tampone fosfato salino (PBS), le sezioni sono state incubate con un anticorpo secondario biotinilato per 20 min a temperatura ambiente. Le sezioni  sono stare nuovamente lavate con PBS e incubate con streptavidina perossidasi per 20 min. Infine, sono state sviluppate le sezioni con 3,3'-diaminobenzidina (Maixin, Fuzhou, Cina) e sono state osservate sotto microscopio . La colorazione di contrasto è stata eseguita con ematossilina. Il siero di capra non immunizzato è stato utilizzato come controllo negativo.

Classificazione con la doppia immunofluorescenza

Gli esperimenti di classificazione con la doppia immunofluorescenza sono stati utilizzati per analizzare la distribuzione spaziale e la localizzazione di CX3CL1 e CX3CR1 a livello della regione apicale. Dopo che le sezioni sono state reidratate, è stata utilizzata l’albumina di siero bovino all’1% (BSA) per 2 h per prevenire la colorazione aspecifica. Le sezioni sono state successivamente incubate a 4 ° C per una notte con anticorpo policlonale di coniglio anti CX3CR1 (1: 50 Santa Cruz Biotechnology;) e isotiocianato di fluoresceina secondario (FITC) coniugato ad anticorpi IgG anti-coniglio (Beyotime Istituto di Biotecnologie, Haimen, Jiangsu, Cina). Il processo è stato ripetuto per gli anticorpi policlonali di capra contro CX3CL1 umano (1: 50), e poi sono stati aggiunti anticorpi secondari di asino anti-capra-Cy3 (Beyotime Istituto di Biotecnologia) per 1 ora a

temperatura ambiente. Le fotografie sono state ottenute utilizzando un microscopio a fluorescenza con una fotocamera (Leica, Solm, Germania).

Analisi statistica

Gli osteoclasti (cellule multinucleate TRAP-positive) e le cellule CX3CL1-positive nei tessuti periapicali di ogni campione sono state conteggiate da un tecnico da cinque aree selezionate in modo casuale a 9400 ingrandimenti.

Il numero medio di cellule per campo ad alta potenza in ogni gruppo è stato analizzato tramite ANOVA a = 0,05 utilizzando il pacchetto statistico SPSS 13.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA).

Risultati

Reperti istologici

Al giorno 0 la regione periapicale si presentava intatta e non è stato osservato alcun riassorbimento osseo. Al giorno 7 è stato osservato una lieve infiltrazione di cellule infiammatorie. Al giorno 14 la maggior parte della polpa radicolare si presentava necrotica e iniziava l’espansione della lesione attiva con concomitante distruzione ossea periapicale.

A partire dal giorno 21 al 28 il tessuto pulpare si presentava completamente necrotico. Si è osservata l’infiltrazione di cellule infiammatorie croniche, la formazione di ascessi attorno all’apice radicolare e riassorbimento osseo alveolare. Il giorno 42 l'espansione della lesione sembrava essersi stabilizzata, anche se era ancora possibile osservare l'infiltrazione delle cellule infiammatorie.

Risultati istochimici enzimatici

Le cellule positive alla TRAP sono state colorate con colori dal rosso scuro al viola e sono state riscontrate vicino alla regione apicale. Non sono stati osservati osteoclasti nelle aree di tessuto periapicale  normale non infiammato. Il numero di osteoclasti è aumentato e ha raggiunto il picco il giorno 14. Il giorno 21, il numero degli osteoclasti ha iniziato a diminuire. Il giorno 42 sono stati osservati pochi osteoclasti. Il maggior numero di osteoclasti per campo ad alta potenza è stato osservato al giorno 14. Sono state osservate differenze significative tra i conteggi degli osteoclasti

in ogni momento.

Risultati immunoistochimici

Le cellule positive per CX3CL1 erano di colore marrone scuro. Non si sono osservate cellule positive per CX3CL1 nelle aree periapicali non infiammate. 7 giorni dopo l'esposizione pulpare sono state repertate alcune cellule CX3CL1. Il giorno 14 la colorazione indicativa della positività al CX3CL1 si localizzava nella polpa necrotica e alla periferia della lesione. Il giorno 21 e 28 sono state osservate molte cellule positive per  CX3CL1 con diverse morfologie, sferica, ovalare e fibroblastica, nel centro o alla periferia della lesione periapicale. Al giorno 42 si è visto che solo una stretta striscia del centro della lesione coincideva con l’infiltrazione delle cellule infiammatorie.

Il numero di cellule CX3CL1-positive ha raggiunto il picco il giorno 28 e il giorno 42 è diminuito. Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra la conta delle cellule positive per CX3CL1 nei giorni 21 e 28.

Classificazione con la doppia immunofluorescenza

La doppia immunofluorescenza ha mostrato la presenza di cellule positive per CX3CR1 e CX3CL1 intorno alle lesioni periapicali che circondano il forame apicale.

La maggior parte delle cellule positive per CX3CL1 erano mononucleate, evento che suggerisce la presenza di macrofagi, neutrofili e linfociti sovrapposte con cellule positive per CX3CR1.

Discussione

Le lesioni periapicali sono una risposta infiammatoria e immunitaria contro i microrganismi che invadono e distruggono la polpa dentale. Una caratteristica aggiuntiva della malattia è il riassorbimento dell'osso alveolare circostante l'apice della radice. Nonostante il grande numero di studi sperimentale e clinici disponibili in materia, gli specifici fattori eziologici e le cellule che partecipano al processo e i mediatori di crescita associati con lo sviluppo, il mantenimento e la risoluzione delle lesioni periapicali rimangono non completamente chiariti (Marton & Kiss 2000).

Anche numerose chemochine partecipano al processo infiammatorio delle lesioni periapicali. Per esempio, la proteina chemio tattica monocitica (MCP) -1 è espressa a livelli più elevati nelle cisti periapicali piuttosto che nei tessuti sani (Silva et al. 2005). MCP-3 è stato rilevato in  granulomi apicali e cisti radicolari in cui si localizzano principalmente i leucociti infiammatori. MCP-3 è stata anche rilevata nell’essudato periapicale, e i suoi livelli erano significativamente maggiori nelle parodontiti apicali sintomatiche rispetto alle asintomatiche (Dezerega et al. 2010). Le proteine ​​infiammatorie macrofagiche (MIP) -1alpha e MIP 1beta sono state descritte nei granulomi periapicali e sono state associate con la modulazione delle lesioni periapicali (Kabashima et al. 2001). CX3CL1 è stato classificato come una chemochina proinfiammatoria. La sua produzione è indotta in condizioni di flogosi, e media il reclutamento e l'adesione di cellule che esprimono CX3CR1. Le interazioni tra CX3CL1 e CX3CR1 possono contribuire allo sviluppo di malattie infiammatorie, come il morbo di Crohn, l'artrite reumatoide e aterosclerosi (Combadiere et al. del 2003, Lesnik et al. 2003 Teupser et al. 2004 Marca et al. 2006 Furuichi et al. 2006 Ishida et al. 2008 Lu et al. 2008, Murphy et al. 2008). Data la natura della parodontite apicale, CX3CL1 e CX3CR1 possono essere coinvolti nel meccanismo di infiammazione dei tessuti periapicali.

In questo studio, l’espressione di CX3CL1 durante lo sviluppo dalla lesione periapicale è stato esaminato. Durante la fase attiva (giorni 7-14) si è verificata l’espansione rapida della lesione e la distruzione ossea. Le aree colorate positivamente per CX3CL1 al giorno 14 sono in gran parte situate nella polpa necrotica e alla periferia della lesione, il che suggerisce che la chemochina è fortemente espressa durante la fase acuta della malattia dalle cellule intorno alla lesione. L’esame della doppia colorazione con l’immunofluorescenza ha dimostrato la presenza di cellule positive per CX3CL1 e CX3CR1 in tutte aree di ratto in cui era stata indotta lo sviluppo di lesione periapicale durante il decorso della parodontite apicale. Si è supposto che CX3CL1 potesse essere un agente

chemiotattico e agire come una molecola di adesione che inducesse la ridistribuzione dei leucociti infiammatori positivi per CX3CR1ai siti di infiammazione. La maggior parte delle cellule positive per CX3CL1 erano monociti, macrofagi, fibroblasti e cellule endoteliali,riscontro che concorda con i risultati precedenti (Ruth et al. 2001). CX3CR1, recettore unico per CX3CL1, viene espresso prevalentemente in cellule infiammatorie, tra queste monociti / macrofagi e cellule T, evento che concorda anche con i precedenti risultati (Murphy et al. 2008). Si evince dunque che CX3CL1 può agire in maniera autocrina.

L’asse CX3CL1-CX3CR1 può essere coinvolto nel reclutamento dei leucociti ai siti infiammatori, alterando lo sviluppo delle risposte delle cellule T allergene-specifiche o influenzando l'espressione di mediatori infiammatori, quali citochine e chemochine, durante la fase di sviluppo attivo della lesione periapicale.

Oltre al loro ruolo nella infiammazione, diverse chemochine hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella osteoclastogenesi. Ad esempio, CCL2 osteoblastica può reclutare massivamente i monociti precursori degli osteoclasti, può facilitare il recettore attivatore di NF-kappa B ligando (RANKL) che induce l’osteoclastogenesi e può migliorare la fusione (Li et al. 2007). CCL3, che viene anche indotto da RANKL durante la differenziazione degli osteoclasti è un

noto fattore osteoclastogenico nel mieloma multiplo (Choi et al. 2000). CX3CL1 svolge anche un importante ruolo nel processo di osteoclastogenesi per mezzo di CX3CR1 che è espresso dai precursori degli osteoclasti (Koizumi et al. 2009), che indica che CX3CL1 può anche agire in modo paracrino. Dato che CX3CL1 è una citochina osteoclastogenica, si può dedurre che partecipa al riassorbimento osseo nella malattia periapicale interagendo in parte con CX3CR1. Questa ipotesi deve essere ulteriormente esplorata.

Durante la fase cronica di sviluppo della lesione periapicale (dal giorno 21 al giorno 42), la presenza prolungata di sostanze microbiche irritanti fa sì che  la lesione principalmente sostenuta da neutrofili si trasformi in una lesione ricca di macrofagi, linfociti e plasmacellule circondata e incapsulata da tessuto connettivo collagenico (Nair 2004, Teixeira et al. 2011). Gli autori hanno affermato che l’attività di riassorbimento osseo inizia a diminuire dal giorno 21 al 42, evento che coincide con una diminuzione del numero di osteoclasti.

Dal giorno 21 al giorno 42, si osserva una vasta area di riassorbimento, ma è stato rilevato solo un piccolo numero di osteoclasti. Anche se le lesioni sembravano stabilizzarsi durante questo periodo con diminuzione del riassorbimento osseo, non si è osservata nuova formazione ossea per la presenza di fattori aggressivi.

Questo risultato è in accordo con i risultati di Teixeira et al. (2011). Una diminuzione nell'espressione di CX3CL1 è stata osservata il giorno 42, e la colorazione positiva per CX3CL1

è stata osservata in una stretta striscia al centro della lesione, riscontro che coincide con l’infiltrazione di cellule infiammatorie. La doppia  colorazione all’esame dell’immunofluorescenza ha indicato che le cellule positive per CX3CL1 e CX3CR1 sono distribuite attorno all'apice del dente. La maggior parte delle cellule positive per CX3CL1 erano mononucleate, evento che suggerisce la presenza di macrofagi, neutrofili infiltranti e linfociti che si sovrapponevano con le cellule positive per CX3CR1. Si può dedurre che la diminuzione dell’espressione di CX3CL1 può limitare la distruzione ossea, e che CX3CL1 può svolgere ruoli più importanti nella fase attiva delle lesioni periapicali. Ulteriori studi dovrebbero essere effettuati per esplorare il meccanismo dettagliato sottostante la patogenesi delle lesioni periapicali.

Conclusione

I risultati indicano che CX3CL1 e CX3CR1 sono legati allo sviluppo di lesioni periapicali e  possono essere coinvolti nella progressione della distruzione dei tessuti, processi tra cui si riconosce il riassorbimento osseo che avviene durante i processi di flogosi periapicale.

Riconoscimento

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del National Natural Science Foundation of China (no.81000434 e 81.170.956).

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