Dicembre 2013

Predisposizione genetica alla Periodontite Apicale Persistente
Jussara M. Morsani, MS, DDS, Anita Aminoshariae, MS, DDS, Yiping Weng Han, PhD,
Thomas A. Montagnese, MS, DDS, and Andre Mickel, MS, DDS

Abstract

Introduzione: La citochina pro-infiammatoria  interleuchina (IL)-1 è un regolatore fondamentale delle risposte dell’ospite alle infezioni microbiche  ed uno dei principali modulatori del catabolismo della matrice extracellulare e del riassorbimento osseo. L’ allele 2 dell’interleuchina IL-beta (IL-1b) è associato con un aumento di 4 volte nella produzione di  IL-1b.
Lo scopo di questo studio caso-controllo è valutare il polimorfismo del gene dell’interleuchina IL-1b nella patogenesi del fallimento endodontico. Noi ipotizziamo che il polimorfismo (allele2 of IL-1b) potrebbe influenzare la risposta dell’ospite ed aumentare le reazioni infiammatorie che predispongono alla periodontite periapicale persistente  (PAP).

Materiali e Metodi: i soggetti con almeno 1 anno di follow-up dopo trattamento endodontico (RCT) sono stati richiamati per lo studio. Sono stati applicati criteri di inclusione ed esclusione e sono stati reclutati 34 soggetti con segni e sintomi di PAP con trattamenti canalari altrimenti accettabili. 61 controlli hanno mostrato la guarigione con trattamenti canalari accettabili. Il DNA proveniente dalla mucosa orale è stato amplificato dalla PCR, seguita dalla “tecnica di restrizione del polimorfismo della lunghezza del frammento”, per distinguere gli alleli nel polimorfismo genetico dell’ IL-1b.

Risultati: Si è evidenziata una differenza significativa nella distribuzione del genotipo polimorfico fra i casi (70.6%) ed i controlli (24.6%) (P < .001, Pearson c2).

Conclusioni: Questi dati suggeriscono che markers genetici specifici associati con l’aumento di produzione di IL-1b potrebbero contribuire all’aumento della suscettibilità alle  PAP. (J Endod 2011;37:455–459) Scopo ultimo del trattamento endodontico (RCT) è la guarigione completa della patologia periapicale ed il ripristino della funzione. I fallimenti possono comunque avvenire nonostante siano stati seguiti tutti gli accorgimenti e la stretta adesione ai principi della terapia endodontica in una percentuale variabile dal 14% al 16% dei casi. (1). Nair (2) ha definito la periodontite apicale come una sequela dell’infezione endodontica che comprende un incontro dinamico fra fattori microbici e difese dell’ospite. La patologia periapicale è una malattia multifattoriale  (3) che rappresenta  un’interazione fra  a un agente microbico ed la risposta immunitaria, che porta alla produzione di citochine e, infine, al riassorbimento osseo.

Nair (1) ha riportato che gli effetti locali dell’interleuchina (IL)-1  comprendevano un’aumentata adesione leucocitaria alle pareti endoteliali, la stimolazione dei linfociti, il potenziamento dei neutrofili, la produzione di prostaglandine e di enzimi proteolitici, l’aumento del riassorbimento osseo e l’inibizione dell’osteogenesi. L’interleuchina IL-1b è la forma predominante di interleuchina presente nelle lesioni periapicali dell’uomo e nei loro essudati(4–7),mentre l’interleuchina  IL-a viene primariamente coinvolta nelle periodontiti periapicale nei ratti (8, 9).

Nell’uomo, IL-1b costituisce il fattore d’attivazione più efficace per gli osteoclasti, cosa che riflette sia un alto livello di espressione sia di potenza biologica (10, 11). Si è dimostrato che IL-1 è  approssimativamente 500 volte più potente del fattore di necrosi tumorale nella stimolazione del riassorbimento osseo (11).

Fattori genetici influenzano le risposte infiammatoria ed immunitaria in generale, e gli individui possono rispondere in modo diverso ai comuni insulti ambientali. Così una risposta differenziale viene influenzata dal profilo genetico individuale. I polimorfismi genetici sono tipi di varianti genetiche che possono contribuire alle malattie complesse(14).

Pociot e altri  (15) hanno riportato che l’allele  2 dell’interleuchina IL-1b a+3953 era associato con un aumento di quattro volte nella produzione di IL-1. Kornman e Giovine (16) hanno documentato un’associazione fra il polimorfismo dei geni che codificano per l’IL-1a (-889) e IL-1b (+3953) ed un aumento della severità della periodontite. Il riassorbimento radicolare apicale durante il trattamento ortodontico ha un rischio aumentato di 5-6 volte nei pazienti omozigoti per l’allele 1 dell’interleuchina IL-1b  (17). I prodotti risultanti dei frammenti  85 bp + 97 bp  (allele 1) ed un singolo frammento di 182-bp  (allele 2) sono indicativi di polimorfismo genetico. La periodontite apicale di origine endodontica mostra similarità con la malattia parodontale per la presenza di microrganismi simili (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedius, ed altri). Può lo stesso profilo genetico influenzare la periodontite apicale persistente, la malattia parodontale ed il riassorbimento radicolare esterno  apicale ? Nel 1997, Kornman ed altri (18) hanno mostrato che specifici markers genetici erano associati con un aumento della produzione di IL-1 ed erano  forti indicatori della suscettibilità alla periodontite apicale severa negli adulti.Gli autori hanno rilevato che il genotipo composito (allele 2 dell’interleuchina IL-1a ed IL-1b) era presente nel 78% dei casi di periodontite severa, nel 26% di periodontite moderata e nel 16% delle periodontiti lieve (odds ratio: severa vs lieve= 18.9). Sulla base del livello di evidenza degli studi di parodontologia e del meccanismo d’azione della interleuchina IL-1b, l’obiettivo di questo studio era valutare la relazione delle variazioni genetiche del gene dell’interleuchina IL-1b e la periodontite apicale persistente.

Si è ipotizzato che un polimorfismo nel gene che codifica l’ IL-1b, che è riconosciuto capace di influenzare la risposta dell’ospite aumentando le reazioni infiammatorie, sia associato con un rischio aumentato di periodontite apicale persistente.

Materiali e Metodi

Reclutamento dei pazienti. Questo studio caso-controllo retrospettivo è stato ideato per esaminare la potenziale associazione fra polimorfismo genetico nel gene dell’interleuchina IL-1b e la periodontite apicale persistente (PAP). Il protocollo è stato approvato dall’Institutional Review Board of Case Western Reserve University, ed ogni paziente ha firmato un consenso dopo essere stato informato della natura dello studio. I partecipanti sono stati reclutati durante i normali richiami (follow-up) della clinica endodontica Case School of Dental Medicine e da quattro ambulatori privati. E’ stato chiesto di partecipare volontariamente a questo studio ai soggetti di età superiore agli anni 18 e in buone condizioni di salute generale che rispondevano ai criteri di inclusione/esclusione. I criteri di inclusione erano i seguenti: mancanza di ragioni ovvie di fallimento della terapia endodontica, trattamento endodontico in seduta singola o multipla, impiego o non impiego  della medicazione intermedia e buone condizioni di salute generale.

I criteri di esclusione comprendevano pazienti minori di anni 18, la presenza di microleakage (cioè, margine aperto e fallimento del restauro), canali dimenticati, strumenti separati all’interno del canale, otturazione canalare più corta di 2 mm dall’apice radiografico, otturazioni canalari iperestese o sovraestese, otturazioni scarsamente compattate, presenza di fratture verticali, molte patologie sistemiche (cioè malattie  cardiovasculari, infezione da HIV /AIDS, diabete non controllato, disordini del sistema immunitario o le malattie del sangue, la radioterapia o la chemioterapia), e le medicazioni che influenzano la reazione infiammatoria-immunitaria (cioè i corticosteroidi e l’uso prolungato dei FANS ). Sono stati esaminati 150 pazienti; 95 (63%) erano idonei a prender parte allo studio sulla base dei criteri di inclusione/esclusione analizzati da quattro esaminatori calibrati. I soggetti con periodontite apicale persistente o fallimento endodontico privo di ovvie ragioni sono stati inclusi nel gruppo dei “casi”. La periodontite apicale persistente è stata definita come segue: (1) mancanza di guarigione in sistemi canalari apparentemente ben otturati come evidente dagli esami radiografici, (2) trattamento endodontico completato almeno un anno prima con segni e sintomi di patologia, (3) la lesione radiografica  preesistente rimaneva dimensionalmente invariata o risultava aumentata, e (4) la presenza di un segno clinico o di un sintomo di malattia periapicale (fistola, dolore, e gonfiore) I soggetti che avevano i trattamenti endodontici privi di segni o sintomi di patologia ad almeno un anno di richiamo sono stati assegnati al gruppo di controllo (gruppo guarito).I criteri seguenti sono stati seguiti come guide pratiche per determinare una prognosi favorevole

(1)  assenza di dolore e gonfiore,

(2)  scomparsa del tragitto fistoloso,

(3)  non perdita della funzione,

(4)  non evidenza di distruzione tessutale e

(5)  risoluzione radiografica della lesione dopo un intervallo post-trattamento di almeno 1 anno.

Lo stato periapicale è stato stabilito utilizzando l’ “index periapicale” (19). Se il primo esaminatore non era abile a determinare chiaramente l’indice periapicale, il secondo esaminatore veniva reclutato per verificare questo parametro fino al raggiungimento del consenso. In occasione della visita di richiamo venivano eseguite due radiografie dei denti trattati endodonticamente e si procedeva all’esame intra ed extraorale per valutare il dente e/o ogni lamentela del paziente legata al trattamento. Le radiografie di controllo venivano comparate con quelle postoperatorie immediate. La presenza di una lesione dopo RCT e la preesistenza di un qualunque sintomo post-endodonzia veniva recuperato dalle cartelle disponibili o direttamente dal paziente durante la visita di controllo. In questo studio c’erano 34 casi con PAP (periodontite apicale persistente) e 61 controlli (gruppo guarito).

Analisi del polimorfismo genetico

Per raccogliere il campione per eseguire le analisi del DNA, l’interno della guancia è stato sfregato con 10 passaggi (stroke) di uno spazzolino sterile di setole di nylon (Gentra Systems, Minneapolis, MN). Il DNA genomico è stato ottenuto da questi campioni utilizzando il Kit di purificazione del DNA Puregene (Gentra Systems). Il  DNA è stato conservato  a 4 gradi centigradi fino a completare la tipizzazione del genoma.

L’analisi del polimorfismo genetico è stato realizzato mediante il metodo modificato descritto da Al-Qawasmi ed altri (17). La reazione a catena polimerasica (PCR) per l’amplificazione del gene dell’ IL-1b (+3954) è stata realizzata utilizzando l’ AccuPrime High Fidelity Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) che utilizza un sistema di termociclaggio Applied Biosystems 2720  (Applied Biosystems, Foster City, CA).Un totale di 1 mL di DNA da ogni campione di DNA è stato utilizzato come schema in una miscela di reazione di 50-mL contenente 2 mmol/L  di  primer “in avanti” (50-CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAA-30) e 2 mmol/L primer “inverso” (50-GCTTTTTTGCTGTGAGTCCCG-30).

Le condizioni della PCR erano le seguenti: 1 ciclo a 94C per 2 minuti; 38 cicli per 1 minuto ciascino a 94C, 60C, e 68C; ed un ciclo finale a 72C per 8 minuti.

Il prodotto della PCR  (30 mL) è stato digerito con  2 mL TaqI (New England Biolabs, Ipswich, MA) a 65° C per 3 ore ed esaminato mediante elettroforesi utilizzando il gel Ready al 10% TBE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Dopo elettroforesi, ogni gel è stato colorato con 0.2 mg/mL di ethidium bromide e visualizzato sotto luce ultravioletta utilizzando il sistema KODAK 1D (Scientific Imaging Systems, New Haven, CA).

Analisi statistica

L’analisi del chi-quadro ed il t test sono stati utilizzati per analizzare la distribuzione dei fattori di studio fra i casi ed i controlli. Inoltre, l’analisi di regressione logistica è stata realizzata per misurare la forza dell’associazione  fra il polimorfismo dell’interleuchina IL-1b e la presenza di periodontite apicale persistente aggiustata per la presenza di covarianti.

Risultati

In questo studio c’erano 34 casi con periodontite apicale persistente e 61 controlli (gruppo degli elementi guariti). L’influenza del genotipo nel gruppo dei casi è evidente nella distribuzione della frequenza che mostra un’aumentata prevalenza di periodontite apicale persistente nel genotipo dell’allele 2 del polimorfismo dell’IL-1b. I risultati mostrano una differenza significativa nella distribuzione del polimorfismo del genotipo (allele 2 of IL-1b) fra i casi (70.6%) ed i controlli (24.6%) (c2 1 =17.2, P < .001 [Pearson c2). Il genotipo polimorfico è stato definito dalla presenza di almeno un allele 2 nel genotipo, che comprendeva tutti gli eterozigoti e/o tutti i soggetti omozigoti per l’allele 2. Questa classificazione era necessaria a causa del piccolo numero di casi (7) omozigoti per l’allele 2.

Una forte associazione è stata osservata fra i casi con PAP (gruppo dei casi) e la presenza di genotipo comprendente almeno un allele 2 del polimorfismo dell’interleuchina IL-1b (odds ratio = 7.4; intervallo di confidenza, 2.9-18.8; P <.001) (cioè, la presenza di polimorfismo aumentava il rischio di periodontite periapicale persistente di sette volte quando comparato con quelli senza questo  polimorfismo).

L’analisi di regressione logistica è stata realizzata per  misurare la forza dell’associazione fra il polimorfismo dell’ IL-1b e la presenza di periodontite periapicale persistente aggiustata per la presenza di covarianti. I pazienti con almeno un allele polimorfico (allele 2 dell’ IL-1b) erano sette volte più soggetti a sviluppare PAP quando comparati con i pazienti privi di polimorfismo o omozigoti per l’allele 1 (odds ratio = 7.6; intervallo di confidenza 2.4-23.7; P < .001) anche dopo l’aggiustamento di queste covarianti . Questo implica che, dopo l’aggiustamento per le covarianti, l’ odds ratio non cambiava quando veniva comparata con l’odds ratio grezza. La razza, il sesso, l’età e le condizioni mediche sono state incluse come covarianti nel modello di regressione logistica precedente, e nessuno di questi fattori era associato con un rischio prognostico per periodontite apicale persistente. Se i genotipi venivano considerati separatamente come omozigote 1 (tipo “wild”, entrambi alleli 1), eterozigoti, ed omozigoti 2 (entrambi alleli 2) , l’odds ratio grezza (non aggiustata) sarebbe stata 11.5 per l’omozigosi 2 ma con un ampio intervallo di confidenza. Questa è un’evidenza preliminare e provocatoria per una possibile correlazione con la dose che necessiterà di essere confermata con studi più grandi ed una valutazione quantitativa dei prodotti del gene.

Discussione

I batteri sono la causa della malattia parodontale oltre che della periodontite apicale (20–23), ma altri fattori possono determinare la severità della malattia e come il singolo specifico paziente risponde alla terapia o ai batteri patogeni (24).

I batteri sono ancora necessari per iniziare la riposta infiammatoria dei pazienti, ma altri fattori possono modulare o amplificare quella risposta infiammatoria fino a cambiare la presentazione clinica e la progressione della malattia (25–28).Il fumo, il diabete e le influenze genetiche predispongono certi individui ad un alto rischio di infezione (26, 29). Molti studi recenti sono stati intrapresi per definire e valutare i possibili contributi genetici al rischio di di sviluppare la periodontite dell’adulto ed altre malattie infiammatorie croniche. Ad esempio, lo studio di  Korman e Giovine (16) ha esaminato il polimorfismo dell’interleuchina IL-1 nella periodontite cronica. I risultati mostrano che, ad eccezione dei fumatori, un particolare allele per l’interleuchina IL-1 è significativamente associato alla parontite severa dell’adulto. I risultati suggeriscono che un particolare genotipo dell’ IL-1 e l’abitudine al fumo possono essere fattori di rischio indipendenti per la malattia parodontale. Trasportando questa prospettiva all’endodonzia, noi abbiamo studiato se specifiche varianti genetiche in questo gene ad azione pro-infiammatoria  (allele 2 dell’ IL-1b) contribuscono alla risposta individuale all’insulto microbico predisponendo a malattie complesse multifattoriali come la periodontite apicale persistente (PAP). I risultati di questo studio suggeriscono che uno specifico genotipo nel cluster genetico dell’ IL-1b è associato con un’aumentata frequenza di segni e sintomi dopo trattamento endodontico. Così alcuni individui possono avere un meccanismo genetico, se stimolati  da  ammassi batterici, che  può portare a una più vigorosa risposta immuno-infiammatoria nella patogenesi della PAP. Questo è il primo articolo che descrive un marker genetico che può identificare persone con un aumentato rischio di PAP prima di iniziare il trattamento endodontico.

L’associazione del genotipo dell’IL-1b con la PAP sembra unire molti filoni di ricerca. Si noti che il polimorfismo dell’interleuchina IL-1b sia riconosciuto essere associato con la quota di produzione di IL-1b in vitro.

I monociti di persone omozigoti per l’allele 2 dell’IL-1b +3954 producono una quantitativo di IL-1b quattro volte superiore rispetto alle cellule omozigote per l’allele 1 (di tipo normale) mentre le cellule eterozigote ne producono approssimativamente il doppio (15). Questo aumento nella produzione di IL-1 potrebbe contribuire a perpetuare la risposta infiammatoria trovata nell’area apicale dei denti anche dopo trattamento endodontico. Alcune evidenze quantitative in vitro si allineano anch’esse con le osservazioni preliminari di un aumentato rischio di PAP associato in particolare con l’omozigosi per l’allele 2 rispetto alla condizione di eterozigosi quando comparati con il tipo wild.

Questi risultati sono in accordo con i dati di Kornman ed altri (18). Nel loro lavoro Kornman ed altri hanno mostrato che specifici markers genetici  associati con l’aumentata produzione dell’ IL-1 sono forti indicatori della suscettibilità alla periodontite severa nell’adulto. Gli autori hanno rilevato che il genotipo composito (allele 2 dell’ IL-1a e dell’IL-1b) sono presenti nel  78% dei casi di periodontite severa nel 26% di periodontite moderata, e nel 16% dei casi di periodontite lieve (odds ratio: severa vs moderata = 18.9). Socransky ed altri (30) hanno anch’essi suggerito che nei pazienti con genotipo positivo per l’IL-1 (allele 2), i pezzi saranno in situ per un’infezione più cronica e persistente ed una conseguente infiammazione. Pociot ed altri (15) hanno riportato che il polimorfismo bi-allelico del gene dell’IL-1b gene in posizione +3954 è risultato nella produzione di una quota più alta di questa citochina secreta dai monociti. De Sa ed altri (24) hanno valutato l’influenza del polimorfismo genetico sullo sviluppo degli ascessi dentali sintomatici studiando cinque polimorfismi funzionali genetici: CD14, IL-1b, IL-6, IL-10, ed il fattore di necrosi tumorale-a. I loro studi suggeriscono che i fattori genetici sono associati con la suscettibilità a sviluppare ascessi dentali sintomatici.

L’implicazione clinica è che i pazienti che devono essere sottoposti a trattamento endodontico potrebbero essere sottoposti a screening per il genotipo dell’IL-b analizzando il DNA da un semplice striscio della guancia per identificare quelli che sono portatori di alleli ad elevato rischio (allele 2 of IL-1b). Sarebbe dunque possibile informare i pazienti sulla loro predisposizione prima di iniziare il trattamento. Le modifiche del trattamento per quelli ad alto rischio possono includere medicazioni intracanalari fra un appuntamento ed il successivo, monitoraggio e follow up più frequente, o l’estrazione. Un approccio più aggressivo durante e dopo trattamento endodontico in questi pazienti ad alto rischio può includere sciacqui preoperatori antimicrobici, preparazioni apicali più ampie(31) per ridurre il numero di microrganismi (32), e l’inclusione di clorexidina al 2% in combinazione con l’ipoclorito di sodio per detergere e sagomare il sistema dei canali radicolari (33).L’endodonzia in più sedute con l’uso di idrossido di calcio per 7-10 giorni si può considerare con certi individui  (32, 34). In accordo con Ng ed altri (1), il fallimento può avvenire nonostante siano stati compiuti tutti gli sforzi  e la stretta aderenza ai principi della terapia endodontica nel 14-16% dei casi.I pazienti dovrebbero inoltre essere informati della possibile necessità dell’endodonzia chirurgica nei casi in cui la guarigione non venga raggiunta.

Comunque, i limiti di questo studio che comprendono la piccola dimensione del campione e la diversità etnica nel gruppo dei soggetti dev’essere attentamente considerata. Gli effetti di queste limitazioni non sono conosciuti e potrebbero portare a risultati ambigui o potrebbero avere associazioni più forti. Un’altra limitazione di questo lavoro è il limite dell’analisi  del polimorfismo dell’interleuchina IL1-b. Nel lavoro di Kornman e Giovine (16), è stato valutato un genotipo composito. Questo genotipo composito comprendeva sia l’interleuchina IL-1a sia l’interleuchina IL-1b per valutare la severità della periodontite.

I risultati di questo studio non sono in accordo con quelli di altri lavori (35, 36). Siqueira ed altri (35) hanno riportato che avevano o una piccola associazione o nessuna associazione tra il polimorfismo e la periodontite apicale post-trattamento.  Le differenze si potrebbero spiegare con il campione più piccolo di quel lavoro. Il polimorfismo era stato testato infatti con un numero di casi (n = 16) di polimorfismo genomico dell’interleuchina IL-1b pari alla metà di quella del presente lavoro (n = 34). Comunque gli autori non avevano riportato che l’allele 1 (per IL-1A e per IL-1B) era sempre più alta nei casi “malati” rispetto ai soggetti guariti/in via di guarigione, ma senza significatività statistica. Inoltre gli autori hanno riportato che solo i soggetti con entrambi gli alleli, H131 e  NA2 erano fortemente associati alla malattia  (87.5% dei pazienti e 49% dei controlli P < .01).  Un lavoro recente di Burgener ed altri (36)  non ha riportato un livello significativamente più alto di IL-1b o di sialoproteina dentinale nel fluido crevicolare dei denti con periodontite apicale; l’osservazione di una presenza di un livello significativamente più alto del livello delle proteine totali nel fluido crevicolare dei denti ammalati ha suggerito il possibile ruolo del livello totale di proteine come marcatore di malattia periapicale.

Se potremo conoscere le basi genetiche delle malattie, avremo presto a disposizione i test genetici per stabilire il rischio di malattia e per sviluppare le opportune modifiche al trattamento. Noi potremmo ancora essere lontani dalla determinazione delle basi genetiche della PAP, ma possiamo acquisire alcune  intuizioni per comprendere come il polimorfismo genetico può influenzare la risposta dell’ospite. Per comprendere pienamente i fattori genetici correlati alla PAP sono richiesti studi genetici più formali che comprendano un disegno del lavoro più rigoroso, con una dimensione del campione aumentata, studi in doppio cieco, studi di segregazione ed alla fine, idonee analisi  delle associazioni. Studi ulteriori potrebbero includere il testaggio del disequilibrio con DNA parentale per rilevare la trasmissione eccessiva dei genotipi associati alla malattia che possono influenzare la prole.

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Genetic Predisposition to Persistent Apical Periodontitis